sábado, 9 de mayo de 2020

Pruebas diagnosticas para Covid-19

Introducción:

El nuevo virus SARS-CoV-2 pertenece a la subfamilia de coronavirus (CoV), de la familia Coronaviridae, y en concreto, al género beta (beta-coronavirus) al igual que el SARS-CoV causante del brote surgido en China en 2003 y el MERS-CoV, causante del brote aparecido en la península arábiga en 2012, siendo todos ellos de origen zoonótico (el huésped originario es el murciélago), que en un momento dado han evolucionado y han cruzado la barrera entre especies hasta causar el brote infeccioso en humanos. Cabe resaltar que hay otros coronavirus que afectan a los humanos de forma cotidiana, causando enfermedades leves del aparato respiratorio, como por ejemplo los resfriados comunes (229E, NL63, OC43, o HKU1) siendo todos ellos del subgrupo de alfa-coronavirus).

Reciben este nombre por la estructura que poseen, que, vista al microscopio, les confiere de una especie de halo o corona en su superficie exterior. Los virus están compuestos esencialmente por material genético y proteínas estructurales que lo encapsulan. La Figura 1 muestra una imagen esquematizada de la forma y estructura de los coronavirus. Constan de la nucleocápside, donde está estrictamente contenido el material genético (exclusivamente una secuencia sencilla de ARN de alrededor de 32,000 bases), y empaquetado gracias a la proteína N, y de la envoltura, compuesta por varias proteínas estructurales como la glucoproteína de membrana o proteína M, implicada en el ensamblaje del virus y en contacto con la nucleocápside, la proteína S, que forma las espigas responsable de la adhesión a la célula huésped, y la proteína E, que interacciona con la proteína M para la formación de la envoltura. Estas representan las proteínas estructurales más relevantes, aunque hay otras que son necesarias en el proceso replicativo del virus y de infección y entrada en las células.

Tipos de Inmunoglobulinas


Los coronavirus se caracterizan por tener una capacidad de mutación relativamente alta comparada con otros virus, lo que dificulta en cierta medida tanto el desarrollo de métodos de diagnóstico específicos como de terapias y vacunas.

Como se reproduce el Covid-19


Evolución de la detección ARN viral y Anticuerpos por Covid-19


Fases de la Covid-19


En términos generales, los métodos de detección de virus respiratorios podrían clasificarse en tres estrategias diferenciadas, cada una de ellas con sus ventajas y limitaciones:
  1. Detección directa del material genético del virus (ARN contenido en la nucleocápside) mediante la PCR
  2. Detección directa del virus como entidad individual, mediante la detección de antígenos virales (proteinas del virus).
  3. Detección Indirecta de los anticuerpos generados en el organismo huésped infectado en muestras de sangre (test serológico).

1. Detección del material Genético  - PCR:

Esta estrategia es la que usa la técnica de PCR (Polymerase Chain Reaction, Reacción de la polimerasa en cadena). Es una técnica muy establecida, utilizada de manera rutinaria en todos los laboratorios clínicos y que está basada en la amplificación de fragmentos de ADN mediante ciclos consecutivos de incrementos y bajadas de temperatura, lo que permite, a partir de pocas secuencias iniciales de ADN (pocas copias de material genérico) ampliar a grandes cantidades que pueden ser detectadas mediante fluorescencia.
La técnica amplifica ADN, por lo que en el caso de del ARN vírico es necesario primero convertirlo a ADN (por transcripción inversa, RT, reverse transcription) para a partir de entonces iniciar el proceso de PCR (lo que se llama RT-PCR). Una vez el genoma de interés es secuenciado (como en el caso del SARS-CoV-2, cuya secuencia fue dilucidada a las pocas semanas de su aparición), es necesario encontrar aquellas regiones únicas que lo diferencian de otros virus de la misma familia (que serán las que se amplificarán, previo diseño de sondas de detección), para otorgar a la técnica de la especificidad necesaria.
Los pasos necesarios para llevar a cabo la detección mediante test PCR son:
Técnica de recogida de la muestra nasofaríngea: Los hisopos nasofaríngeos son más estrechos y flexibles que los orofaríngeos. Las torundas deben ser de dacrón o poliéster. El hisopo se introduce en una de las fosas nasales y se desplaza por el suelo de la cavidad nasal siguiendo el tabique hasta la nasofaringe, hasta la muesca de seguridad, sin forzar si se encuentra resistencia. Se gira la torunda con suavidad durante 5-10 segundos. A continuación, se debe introducir el hisopo en un medio de transporte adecuado, para virus o universal, romper el mango del hisopo por la muesca y cerrar el tapón, a no ser que se vaya a usar de forma inmediata en un test rápido. Las muestras se embalan en contenedores homologados bajo normativa de “Sustancia biológica clase B (UN3373) y se transportan en frío, a 4ºC.

Medidas de seguridad para recoger las muestras: La recogida de las muestras se debe realizar según las recomendaciones oficiales de la OMS y el Ministerio de Sanidad (https://www.mscbs.gob.es/profesionales/saludPublica/ccayes/alertasActual/nCov-China/documentos/Procedimiento_COVID_19.pdf) con un equipo de protección individual (EPI) para la prevención de infección por microorganismos transmitidos por gotas y por contacto que incluya bata impermeable a fluidos, mascarilla FFP2, guantes y protección ocular (gafas o pantalla facial). La recogida de muestras de vías bajas genera aerosoles por lo que es elevado el riesgo de contagio y debe realizarse con la protección y medidas adecuadas5 (además de la misma protección que para la recogida de muestras respiratorias de vías altas, se deben realizar en una habitación adecuadamente ventilada: como mínimo, ventilación natural con un flujo de aire de al menos 160 litros/segundo por paciente, o habitaciones de presión negativa con al menos 12 cambios de aire por hora).

Técnica de realización de la RT-PCR: La RT-PCR se realiza en laboratorios de Microbiología clínica, necesita personal experto en Microbiología molecular y medidas de bioseguridad. La muestra debe ser en primer lugar inactivada. La PCR es una técnica utilizada para amplificar secuencias de ADN7,8. Consta de dos fases: extracción y amplificación de los ácidos nucleicos. El ARN es monocatenario y muy inestable por lo que primero debe transcribirse de forma inversa en ADN complementario (ADNc) utilizando una transcriptasa inversa. A partir de aquí, se utiliza el procedimiento de PCR convencional para amplificar el ADNc. Se utilizan secuencias cortas de ADNc, cebadores o primers, para seleccionar la parte del genoma a amplificar. La temperatura de la muestra se sube y se baja repetidamente para ayudar a la ADN polimerasa a duplicar la secuencia del ADN que está siendo copiada. Con esta técnica se producen millones de copias de la secuencia estudiada en unas horas. Lo ideal es que ambos procesos estén automatizados para aumentar la rapidez y evitar errores. En la actualidad el resultado de las pruebas está disponible desde unas horas a varios días. Otra ventaja de la PCR en el momento actual, con existencia de muchos casos, es que permite procesar simultáneamente un elevado número de muestras1.
Los genes diana más usados para la detección de SARS-CoV-2 son el gen E (recomendado por la OMS como screening de primera línea2), el gen RdRp, para estudio de confirmación y el gen N para estudio adicional de confirmación. Otro gen usado es el Orf1ab. Para el diagnóstico de confirmación en zonas sin circulación del virus COVID-19 se necesita la positividad frente a dos genes distintos de COVID-19, uno de ellos específico del mismo, o positividad frente a un betacoronavirus más una identificación al menos parcial del genoma del virus COVID-19. En zonas de transmisión comunitaria como nuestro país en la actualidad, se considera suficiente la positividad de la rRT-PCR para un único gen que sea discriminatorio2 de COVID-19

Ventajas de la técnica PCR
  • Técnica bien establecida, comercializada por multitud de compañías.
  • Fácilmente adaptable a tantas secuencias diana como sea necesario en un tiempo relativamente corto, una vez se conoce la secuencia genómica a detectar.
  • Producción fácilmente escalable a millares de kits de detección (cócteles de reactivos conteniendo las ondas de reconocimiento).
  • Elevada especificidad, debido a la elección precisa de zonas del genoma exclusivas de la diana a detectar.
  • Elevada sensibilidad debido al proceso inherente de amplificación exponencial.
Limitaciones de la técnica PCR
  • Como se ha comentado, la PCR es la técnica de referencia para el diagnóstico de COVID-19, pero puede haber falsos negativos y falsos positivos.
  • Tiempo de resultado (time-to-result) relativamente largo (requiere de 2 a 5 h para la obtención de resultados). Esto se convierte en un factor limitante cuando hay que procesar y analizar un gran número de muestras como en la situación actual.
    Es una técnica relativamente costosa (coste de test, entre 25-150€ /unidad)
  • Un único resultado negativo en una prueba de PCR, especialmente si se ha realizado a partir de una muestra de las vías respiratorias superiores, no excluye la posibilidad de una infección por SARS-CoV-2. Se recomienda repetir el muestreo, e incluso con una muestra de las vías respiratorias inferiores en caso de enfermedad grave o progresiva.
Falsos negativos: Pueden aparecer si:
  1. la contaminación inherente (Una purificación y aislamiento no adecuado del material genómico puede conducir a resultados erróneos)
  2. La toma de la muestra es inadecuada (cantidad escasa).
  3. El transporte es inadecuado (no se mantiene la cadena de frío) o con retraso.
  4. Hay errores pre-analíticos (mal etiquetado de la muestra).
  5. Hay poca eliminación de virus por el paciente por el estadio del proceso (asintomático, presintomático o postsintomático) o por la gravedad del mismo.

Falsos positivos: Pueden aparecer si:
  1. Hay error pre-analítico en el etiquetado de la muestra a lo largo del proceso
  2. Contaminación cruzada entre muestras durante el procesamiento.

Toma de muestra Nasofaringea y Orogaringea


Toma de muestra por irrigación en niños


Toma de muestra por irrigación en adultos



PCR IgM IgG Interpretación
- - - Negativo - No inmunizado - Paciente en riesgo
+ - - Fase Inicial (preclínica ó clínica inferior a 7 días, periodo ventana en el que la infección ya está presente pero los anticuerpos aún no son detectables) 
+ + - Fase temprana ó aguda de la infección  de 7 a 10 días
- + - Fase activa de más de 7 - 10 (carga viral disminuida). Falso negativo? Repetir PCR.
- + + Fase activa de más de 14 días ( carga viral disminuida; buen pronóstico por IgG)
+ + + Fase activa de infección (posible buen pronóstico por IgG
+ - + Fase final - infección avanzada de más de 14 días (o posible recurrencia)
- - + Fase de resolución - Infección pasada o curada

2. Detección del virus como entidad indivudual - Antigenos:

En este caso, la detección no es del material genérico contenido en la cápside sino del virus entero a partir de la detección de los llamados antígenos virales (es decir las proteínas que lo conforman). Generalmente esta estrategia se basa en la detección de las proteínas estructurales como sería la proteína S, en caso de detección completa del virus, o la proteína N, para detección de partes o fragmentos del virus, mediante el uso de anticuerpos específicos, que las detectan cuando capturan al virus.
Una forma de detectarlo es usar los llamados Tests Rápidos de Detección de Antígenos (RADTs, rapid antigen detection tests). Esta aproximación es sencilla, aunque muy dependiente de la disponibilidad de anticuerpos específicos de cuya calidad dependerá una mayor especificidad y sensibilidad del análisis. Hay actualmente varias casas comerciales que distribuyen anticuerpos para distintas proteínas estructurales del SARS-CoV (principalmente la S y la N) que también reconocen el nuevo virus SARS-CoV-2, con los que se están poniendo a punto distintos tests de detección. De igual manera ya hay actualmente en el mercado distintos tests rápidos para la detección de SARS-CoV-2. Los más habituales se basan en ensayos de flujo lateral o tiras reactivas (salvando algunas diferencias, parecidos a los tests de embarazo disponibles en farmacias). Suelen estar fabricados en materiales adsorbentes (como derivados de celulosa) y contienen ya adsorbidos distintos reactivos (como por ejemplo anticuerpos) que cuando entran en contacto con la sustancia diana a detectar, conducen a un cambio generalmente visual y detectable directamente a ojo (cambio de color en la zona de detección).
Los pasos necesarios para realizar el test de detección de virus son:
  1. Colección de la muestra del paciente (también en este caso muestra nasofaríngea por contener mayor cantidad de virus)
  2. Mezcla con solución reactiva (generalmente anticuerpos específicos contra algún antígeno viral) 
  3. Transferencia directa de unas gotas de la mezcla en la tira reactiva y lectura de la respuesta (visual generalmente) al cabo de pocos minutos en la zona de captura o detección.
  4. Hay varias empresas biotecnológicas centradas en el desarrollo de tests rápidos basados en este principio de detección. 
Ventajas de tira reactiva para la detección del virus entero

  • Rapidez en la obtención de resultados (entre 5-15 minutos entre la toma de muestra y la lectura de resultados)
  • Bajo coste y producción masiva
  • Es una técnica bien establecida, que comercializan multitud de compañías para otras aplicaciones. Si se dispone de los reactivos (anticuerpos) la técnica es fácilmente adaptable, por ejemplo, si se ha desarrollado previamente para virus similares.
  • Puede ser utilizada directamente en el sitio de toma de muestra, no requiere de instrumentación compleja externa, y no requiere de personal especializado para su análisis ni para la lectura de resultados
  • Con una sensibilidad adecuada, la técnica puede teóricamente diagnosticar la enfermedad desde el primer día en el que el virus está presente en el organismo.
Limitaciones de los ensayos de tira reactiva para la detección del virus entero

  • Limitada sensibilidad. Posibilidad elevada de falsos negativos (ausencia de detección cuando la carga viral es baja).
  • Problemas de reproducibilidad (de lote a lote). Problemas de falsos positivos y/o negativos.
  • Respuesta esencialmente cualitativa (tipo SÍ/NO). No aporta información de la cantidad de virus presente.

3. Detección de anticuerpos generados en el organismo huésped infectado ( Test serológico: IgM/IgG):

Los tests serológicos se basan en la detección indirecta del virus, a través de la medida específica de los anticuerpos generados por el propio organismo de la persona infectada. Ante el ataque de, o exposición a organismos ajenos (como los agentes infecciosos víricos) el sistema inmune humano responde desencadenando la producción de anticuerpos que conferirán cierta inmunidad ante posteriores reinfecciones (en un mecanismo análogo al que desencadenan las vacunas).

Ésta es una aproximación especialmente atractiva porque no es necesario que la infección esté activa, es decir, que el virus este todavía presente en el organismo infectado, por lo que es útil no solo como método de diagnóstico, sino también en estudios epidemiológicos, pues permite medir los niveles de anticuerpos con el tiempo. Además, se puede diferenciar entre distintos tipos de anticuerpos que se producen en las distintas etapas de la infección: por ejemplo, inmunoglobulinas M (IgM) que se generan al principio, y representan un proceso de infección aguda, y las inmunoglobulinas G (IgG), más abundantes, indicativos de infección primaria o que aparecen como respuesta a la fase aguda de infecciones secundarias. En definitiva, los tests serológicos pueden proporcionar información valiosa respecto a una infección activa o a un contagio previo. Puede ser por tanto una herramienta de diagnóstico masivo, especialmente importante en SARS-CoV-2, donde hay un número muy elevado de pacientes asintomáticos y el periodo de incubación parece indicar que puede alargarse hasta aproximadamente 14 días antes de la aparición de síntomas.

Los anticuerpos generados por el organismo suelen tener como diana, determinantes antigénicos clave en el agente patógeno, por ejemplo, las proteínas estructurales del virus. En estos tests, se pone en contacto el suero del paciente con los antígenos del virus de manera que la presencia de anticuerpos en el suero es detectada. La aproximación más sencilla es llevar a cabo tests análogos a los de detección rápida del virus, en formato tira reactiva, comentados en el apartado anterior.
Los pasos necesarios a llevar a cabo en los tests serológicos son:
  1. Colección de muestra de paciente. En este caso, extracción de sangre (y separación del suero, en algunos casos).
  2. Transferencia directa al test (que contiene antígenos del virus) y lectura de la respuesta (visual generalmente) al cabo de pocos minutos en la zona de captura o detección.
Ventajas de los tests serológicos en tira reactiva

  • Rapidez (entre 5-15 min entre extracción de muestras y resultados).
  • Muestra de sangre capilar, lo que implica extracción sencilla mínimamente invasiva. Muestras con baja o nula carga viral y por tanto no infecciosas (no se espera presencia del virus en estas muestras).
  • Es una técnica bien establecida y adaptable a diferentes formatos de diagnóstico una vez se dispone de los antígenos más adecuados para preparar los tests.
  • Producción masiva y posiblemente de bajo coste (alrededor de 20-50€ por test).
  • Puede ser utilizada directamente en el sitio de toma de muestra, no requiere de instrumentación compleja externa, y no requiere de personal especializado para su análisis ni para la lectura de los resultados.
Limitaciones de los tests serológicos en tira reactiva:
  • Limitada sensibilidad. Posibilidad elevada de falsos negativos.
  • Problemas de reproducibilidad (de lote a lote). Problemas de falsos positivos y/o negativos.
  • Respuesta esencialmente cualitativa (tipo SÍ/NO).
  • El sistema inmunológico requiere un tiempo para activarse y generar los anticuerpos (entre 2-3 días, o incluso más dependiendo del estado de salud de cada persona).
  • Variabilidad inherente la respuesta inmune de cada individuo.

Muestra de sangre capilar


Muestra de sangre venosa

 

Interpretar Resultados

Negativo             Positivo              Positivo             Positivo

Invalido             Invalido             Invalido             Invalido


IgM IgG Interpretación
+ + Infección reciente
+ - Infección reciente
- + Infección previa
- - No hay infección o no hay suficientes anticuerpos detectables en la infección tempra.

Pruebas bioquímicas, inmunológicas y hematológicas alteradas

Las 13 principales alteraciones analíticas en pacientes con Covid-19:
  1. Gasometrías, como en todas las neumonías. Estado ácido base arterial: los pacientes infectados pueden desarrollar de manera súbita insuficiencia respiratoria aguda, por lo que es importante tener presente las alteraciones en la gasometría arterial para poder realizar un correcto diagnóstico y tratamiento.

    El score SOFA o Sequential Organ Failure Assesment, es utilizado frecuentemente en las unidades de cuidados críticos y se calcula en base a parámetros analíticos y clínicos.

    Los principales cambios que veremos en la gasometría arterial son:
    • PaO2 disminuida (menor o igual a 60 mmHg).
    • Aumento de la PaCO2
    • Acidosis respiratoria, que puede presentarse junto a acidosis metabólica porpresencia de ácido láctico.
    • Evaluación del síndrome distrés respiratorio agudo (SDRA)
    • pO2/FIO2 200-300 SDRA leve. 100-199 SDRA moderado. <100 SDRA severo
    • satO2/FIO2 236-315 SDRA leve. <236 SDRA de moderado a severo
  2. Valorar Linfopenia: un número anormalmente bajo de linfocitos, es decir un recuento linfocitario bajo (<0.4* 10^9/L) se asoció de una manera importante al desarrollo de neumonía grave.
  3. Neutrofilia: es el aumento del numero de neutrofilos y la causa más frecuente de leucocitosis, el 87% de los pacientes con una cifra de neutrófilos por encima de 7*10^9/L desarrollaron un peor curso clínico. Recuerde al encontrarse elevada en el primer recuento leucocitario del paciente es la única variable bioquímica predictiva de mortalidad hospitalaria.
  4. Valorar Leucocitosis: aumento en el número de glóbulos blancos, el 96% de los pacientes con recuento leucocitario superior a 10*10^9/L presentaron un cuadro severo
  5. Valorara trastornos de la coagulación sanguinea (Dímero D): El 81 % de los pacientes con niveles de Dímero D superiores a 1 mg/L presentaron un cuadro grave de neumonía, valores de mal pronóstico en el momento del ingreso. También se asoció a la aparición de complicaciones trombóticas.
  6. Valorar trastornos autoinmunes y/o infeccion severa (Proteína C reactiva): Mayores niveles de proteína C reactiva (>150 mg/L) se relacionan con desarrollo de neumonía severa.
  7. Valorara tipo y daño a tejidos (Lactato deshidrogenasa): En el caso de LDH-3, presente en tejido pulmonar, el 100% de los pacientes con neumonía grave presentaron niveles por encima de 720U/L.
  8. Valorar nivel de hierro: Ferritina, los niveles elevados de ferritina (> 2000 ng/mL) se relacionaron con el desarrollo de síndrome hemofagocítico, anemia, dificultad respiratoria, taquipnea.
  9. Valorar biomarcador de infección e inflamación sistemico: Procalcitonina (PCT): La procalcitonina es un marcador de utilidad para vigilar la aparición de sobre infección bacteriana. Niveles superiores a 0,5 μg/L corresponden a un riesgo 5 veces mayor de infección severa.
  10. Valorar daño al cardiaco (Troponina T): Durante la hospitalización los pacientes con niveles elevados de TnT tuvieron más frecuencia de arritmias malignas que los que presentaban niveles de TnT normales. Los niveles altos de troponina en la sangre pueden indicar que usted está teniendo o que ha tenido recientemente un ataque al corazón. Un ataque al corazón ocurre cuando se produce un bloqueo en el flujo de sangre al corazón, lo que puede causar la muerte.
  11. Valorar actividad inflamatoria: Interleucina-6 (IL-6): Los niveles elevados de IL-6 (>80pg/mL), se asocian al desarrollo de SHF y a fallo respiratorio severo.
  12. Valorar el control homeostático del agua corporal, sodio, potasio y tejido adiposo (Péptidos natriuréticos (BNP, NT-prBNP)): La elevación de péptidos natriuréticos son un factor de riesgo de muerte independiente en pacientes con Covid-19.
  13. Valorar funcionamiento del hígado: Analisis de la enzima alanina aminotransferasa (ALT): El aumento de la actividad de la ALT se relacionó con una peor evolución, especialmente con niveles superiores a 40 U/L.









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